一、實驗?zāi)康?/span>

掌握植物細(xì)胞活性快速檢測方法

評估外界脅迫（如重金屬、干旱）對細(xì)胞存活率的影響

為原生質(zhì)體制備、轉(zhuǎn)基因篩選等實驗提供質(zhì)量監(jiān)控

二、實驗原理

死亡細(xì)胞膜完整性喪失，臺盼藍(lán)（Trypan Blue）染料可透過破損的細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合顯藍(lán)色；活細(xì)胞因膜結(jié)構(gòu)完整而拒染保持無色。

三、實驗材料與器具

（1）材料準(zhǔn)備

新鮮植物葉片（擬南芥/煙草）

0.4%臺盼藍(lán)溶液（用PBS緩沖液配制）

酶解液（含2%纖維素酶+0.3%離析酶+0.6M甘露-醇）

（2）儀器設(shè)備

光學(xué)顯微鏡（100-400倍）

血球計數(shù)板

恒溫水浴搖床（25℃）

離心機（1000rpm）

四、實驗步驟

樣本制備階段

葉片消毒：70%乙醇浸泡30s→無菌水沖洗3次

酶解處理：將1cm2葉片置于5mL酶解液，25℃黑暗振蕩3h

終止反應(yīng)：加入等體積0.6M甘露-醇，輕柔吹打10次

染色檢測階段

染色混合：細(xì)胞懸液與臺盼藍(lán)按9:1比例混勻

計時觀察：靜置3min后立即鏡檢（超過5min需重做）

計數(shù)規(guī)則：

血球計數(shù)板四角大方格計數(shù)

細(xì)胞輪廓完整且呈藍(lán)色判定為死細(xì)胞

每個樣本重復(fù)計數(shù)3次

數(shù)據(jù)處理

存活率(%) = (總細(xì)胞數(shù)-藍(lán)色細(xì)胞數(shù))/總細(xì)胞數(shù)×100

五、注意事項

關(guān)鍵控制點：

酶解時間冬季需延長0.5h

染色時避免強光直射

常見問題：

細(xì)胞聚集→增加甘露-醇濃度至0.8M

背景染色→用預(yù)冷PBS沖洗2次