神經(jīng)干細(xì)胞與血管性癡呆大鼠海馬膽堿能神經(jīng)元變化的相關(guān)性
孫玉華，耿利嬌，趙靜雅，賀維亞，李保平(河南大學(xué)淮河醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南省開封市 475001) 

文章亮點(diǎn)：
1 有研究顯示，神經(jīng)干細(xì)胞移植可以增加血管性癡呆模型大鼠腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)細(xì)胞，其機(jī)制可能為外源性神經(jīng)干細(xì)胞在移植區(qū)增殖、分化，并可能促進(jìn)了內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的分化、遷移，改善了大鼠腦內(nèi)局部的微環(huán)境。
2 神經(jīng)干細(xì)胞移植后膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶陽性細(xì)胞增多，從而有效促進(jìn)膽堿能神經(jīng)元分化及生長(zhǎng)，乙酰膽堿增多，使大鼠海馬區(qū)神經(jīng)功能恢復(fù)，并促進(jìn)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的有效改善，其具體機(jī)制目前尚缺乏有利證據(jù)支持。
關(guān)鍵詞：
干細(xì)胞；移植；癡呆；血管性；海馬膽堿能神經(jīng)元；神經(jīng)干細(xì)胞；干細(xì)胞移植；膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶；學(xué)習(xí)記憶能力；乙酰膽堿；SD 大鼠
主題詞：
神經(jīng)干細(xì)胞；癡呆, 血管性；神經(jīng)元；組織工程
摘要
背景：血管性癡呆患者存在額葉皮質(zhì)及海馬膽堿能神經(jīng)元受損，可能是導(dǎo)致患者認(rèn)知功能受損的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。
目的：探討神經(jīng)干細(xì)胞與血管性癡呆大鼠海馬膽堿能神經(jīng)元變化的相關(guān)性。
方法：納入 90 只 SD 大鼠，隨機(jī)均分為 3 組，其中假手術(shù)組僅分離頸總動(dòng)脈，模型組和神經(jīng)干細(xì)胞移植組采用兩血管結(jié)扎法建立血管性癡呆動(dòng)物模型，神經(jīng)干細(xì)胞移植組在建立血管性癡呆動(dòng)物模型之后向大鼠海馬CA1 區(qū)注射 5 μL 神經(jīng)干細(xì)胞，另外兩組按照同樣的操作注射相同劑量的生理鹽水。移植后第 3，7，14，30，60 天，分別處死各組 6 只大鼠，采用 S-P 免疫組化法檢測(cè)各組腦實(shí)質(zhì) BrdU 陽性細(xì)胞和 ChAT 陽性細(xì)胞分布情況，利用 Morris 水迷宮系統(tǒng)檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。
結(jié)果與結(jié)論：BrdU 陽性細(xì)胞主要分布在大腦皮質(zhì)區(qū)以及海馬區(qū)，尤其是血管周圍。在基底核和丘腦以及室管膜區(qū)，可觀察到少量 BrdU 陽性細(xì)胞存在。隨著時(shí)間的推移，BrdU 陽性細(xì)胞數(shù)目不斷下降，到移植后 60 d，僅存在少量 BrdU 陽性細(xì)胞存活。移植后不同時(shí)間模型組和神經(jīng)干細(xì)胞移植組的 ChAT 陽性細(xì)胞數(shù)均顯著大于假手術(shù)組(P < 0.05)；模型組 ChAT 陽性細(xì)胞數(shù)顯著低于神經(jīng)干細(xì)胞移植組(P < 0.05)。模型組尋找平臺(tái)時(shí)間顯著長(zhǎng)于假手術(shù)組，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著少于假手術(shù)組(P < 0.05)；神經(jīng)干細(xì)胞移植組的尋找平臺(tái)時(shí)間顯著短于模型組，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著大于模型組(P < 0.05)。結(jié)果表明神經(jīng)干細(xì)胞可以在大鼠腦內(nèi)存活并發(fā)生遷移，顯著改善血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，相關(guān)機(jī)制可能與海馬膽堿能神經(jīng)元分化和生長(zhǎng)有關(guān)。

引言 Introduction
隨著社會(huì)發(fā)展和人口的老齡化，各種腦血管病的發(fā)病率呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢(shì)[1]。血管性癡呆是一種由腦血管疾病所致的認(rèn)知功能障礙綜合征，嚴(yán)重影響患者和家屬的生活質(zhì)量，也給整個(gè)社會(huì)以及家庭帶來了沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。血管性癡呆的病情發(fā)展十分迅速，在病史中有反復(fù)多次的腦卒中發(fā)作，腦卒中每發(fā)作1次癡呆癥狀加重1次[3]。按照病理形態(tài)可將血管性癡呆分為彌漫性缺血型、多發(fā)性梗死型和重要部位的梗死型，如海馬回、丘腦及額葉的梗死。血管性癡呆會(huì)導(dǎo)致乙酰膽堿合成量和膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性顯著下降[4]。1992年，國(guó)外學(xué)者Reynolds等[5]從成年大鼠紋狀體和海馬中分離出一種特殊的細(xì)胞群，這類細(xì)胞群能自我更新并具有多向分化潛能。隨著干細(xì)胞理論和相關(guān)研究的不斷進(jìn)展，確定了中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在神經(jīng)干細(xì)胞。大量研究發(fā)現(xiàn)，各種原因?qū)е律窠?jīng)細(xì)胞損傷后，可以利用一定的方式進(jìn)行修復(fù)，以達(dá)到治療疾病的目的，其中神經(jīng)干細(xì)胞移植治療是一個(gè)重要的途徑[6-7]。本研究建立血管性癡呆動(dòng)物模型并進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞移植，通過觀察腦實(shí)質(zhì)BrdU陽性細(xì)胞和ChAT陽性細(xì)胞分布情況以及大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，探討神經(jīng)干細(xì)胞與血管性癡呆大鼠海馬膽堿能神經(jīng)元變化的相關(guān)性。
1 材料和方法 Materials and methods 
1.1 設(shè)計(jì) 隨機(jī)對(duì)照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
1.2 時(shí)間及地點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)于2015年4至7月在河南大學(xué)淮河醫(yī)院完成。
1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料 90只成年雌性SD大鼠，體質(zhì)量180-220 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，使用許可證號(hào)：scxk(滬)2015-0015。5只新生1-3 d SD大鼠，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物處置符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。
1.4 實(shí)驗(yàn)方法
1.4.1 動(dòng)物分組與血管性癡呆大鼠模型制作 將90只成年SD大鼠隨機(jī)分為3組，其中模型組30只，神經(jīng)干細(xì)胞移植組30只，假手術(shù)組30只。模型組和神經(jīng)干細(xì)胞移植組均采用兩血管結(jié)扎法建立血管性癡呆動(dòng)物模型。大鼠常規(guī)禁食 12 h、禁水4 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，于頸前部皮膚正中做切口，鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，利用“1”號(hào)線對(duì)兩側(cè)頸總動(dòng)脈進(jìn)行結(jié)扎，結(jié)扎后常規(guī)消毒，縫合皮膚。假手術(shù)組實(shí)施相同的分離操作，僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不結(jié)扎。

神經(jīng)干細(xì)胞移植后血管性癡呆大鼠海馬膽堿能神經(jīng)元變化的實(shí)驗(yàn)所用主要試劑與儀器：

 試劑與儀器 來源 
乙醇 上海樊克生物科技有限公司
胰蛋白酶 上海弘順生物科技有限公司
胎牛血清 北京普博斯生物科技有限公司
移液槍 上海靜融生物科技有限公司
青霉素 上海勝邁醫(yī)療器械有限公司
磷酸鹽緩沖液 上海瑞楚生物科技有限公司
鏈霉素 上海勁馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司
DMEM培養(yǎng)基 百浩生物科技有限公司(北京) 
兔抗大鼠ChAT多克隆抗體 上海古朵生物科技有限公司
鼠抗人BrdU抗體 上海拜力生物科技有限公司
兔抗鼠熒光二抗 中國(guó)北京中杉金橋生物技術(shù)公司
二抗免疫組化試劑盒(SP試劑盒) 北京博奧森生物技術(shù)有限公司
DAB顯色試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司
流式細(xì)胞儀 金華市科迪儀器設(shè)備有限公司
離心機(jī) 上海明茲精密儀器有限公司

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